抗體是生命科學實驗的“基石”，但也是最容易出問題的環節之一。踩中一個“雷區”，就可能導致幾個月的心血白費。以下為您梳理了抗體使用過程中最常見的“雷區”及避坑指南，涵蓋了從存儲到驗證的全流程。
 

　　一、
 

　　錯誤做法：
 

　　將濃縮抗體長期存放在4°C(非“即用型”抗體)。
 

　　反復凍融抗體。
 

　　將分裝抗體存放在冰箱門架上，溫度波動劇烈。
 

　　避坑指南：
 

　　遵循說明書! 絕大多數濃縮抗體必須 -20°C 長期保存。
 

 

　　堅決分裝! 根據使用頻率，將抗體無菌分裝成小份(如5-10μL/管)，避免反復凍融。
 

　　使用抗體存儲盒： 將分裝管放入裝有異丙醇的 -20°C 專用抗體存儲盒中，確保溫度穩定，避免冰晶形成。
 

　　工作液的保存： 稀釋后的抗體工作液通常不穩定，應現用現配，或在4°C短期保存(1-2周)，并加入防腐劑(如0.02% 疊氮化鈉，注意：有毒且會抑制某些酶活性)。
 

　　二、
 

　　錯誤做法：
 

　　直接使用說明書推薦的稀釋度，不進行梯度預實驗。
 

　　不設置或設置錯誤的陽性/陰性對照。
 

　　不同實驗類型(WB/IHC/IF/FC)使用相同的稀釋度。
 

　　避坑指南：
 

　　必須進行抗體滴定! 這是最重要的優化步驟。在您的實驗系統下，做一個梯度稀釋(如1:100. 1:500. 1:1000. 1:2000)，找到信噪比最高的最佳稀釋度。
 

　　設立嚴謹的對照：
 

　　陽性對照： 已知表達目標蛋白的細胞系或組織。驗證實驗體系有效。
 

　　陰性對照：
 

　　實驗陰性對照(至關重要!)： 使用同型IgG 或 不含一抗的緩沖液。這是判斷信號特異性的金標準。
 

　　生物學陰性對照： 已知不表達目標蛋白的細胞系或組織(如基因敲除細胞)。
 

　　明確應用類型： 務必確認抗體適用于您要做的實驗(WB, IHC, IF, FC等)。用于WB的抗體可能不適用于IHC，反之亦然。
 

　　三、抗體使用
 

　　錯誤做法：
 

　　WB轉膜不徹底或過轉。
 

　　IHC/IF中抗原修復方法或條件錯誤。
 

　　封閉不充分或封閉過度。
 

　　洗脫不充分或過于劇烈。
 

　　避坑指南：
 

　　WB：
 

　　驗證轉膜效率：使用可逆的染液(如麗春紅S)或考馬斯亮藍染凝膠，確認蛋白已轉至膜上。
 

　　優化封閉：常用5% BSA或脫脂牛奶，注意磷酸化蛋白檢測需用BSA，因為牛奶中含有酪蛋白磷酸化。
 

　　IHC/IF：
 

　　優化抗原修復：根據目標抗原選擇檸檬酸鹽(pH6.0) 或 EDTA(pH8.0-9.0) 緩沖液，并優化加熱時間/壓力。
 

　　防止切片干燥：任何時候都不要讓組織切片干燥，否則會導致非特異性背景高。
 

　　充分洗滌： 使用足夠的PBST或TBST，每次洗滌5分鐘，洗3次，去除未結合的抗體。
 

　　四、抗體使用
 

　　選擇可靠品牌： 優先選擇CST, Abcam, Thermo Fisher等口碑好的品牌。
 

　　查閱數據： 購買前，務必在上查看該抗體的應用數據(WB、IHC等圖片)和參考文獻。
 

　　利用引用文獻： 在PubMed上搜索該抗體的貨號，查看其他同行在高質量期刊中是如何使用和驗證該抗體的。

 

　　遵循以上指南，您可以極大地避免踩雷，確保實驗結果的可靠性、可重復性和科學性。祝您實驗順利!
 

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